双歧杆菌是人体肠道内重要的生理性细菌之一，其在人体肠道内的数量已经成为人体健康的重要指标之一[1]。目前，双歧杆菌已经成为微生态制剂的研究热点，其被大量应用于食品、保健品以及药品领域。但是由于双歧杆菌是严格的厌氧细菌，这对其发酵和保存造成了技术上的困难，目前市场上很多双歧杆菌产品都不能分离出活的双歧杆菌。根据世界卫生组织规定，益生菌活菌数只有达到106CFU/g以上才具有益生作用[2]。下面将为您介绍富硒长双歧杆菌DD98是如何高密度培养的。
影响益生菌高密度发酵的因素
● 培养基成分：培养基的营养成分对益生菌的生长和代谢有重要影响。氮源、碳源、维生素和矿物质的种类和浓度需要根据益生菌的需求进行优化[3]。此外，培养基的初始pH值也会影响细菌的生长和代谢活性[4]。
● 培养条件：
■ 温度：益生菌有其最适生长温度范围。过高或过低的温度都会抑制其生长和代谢活动。
■ pH值：益生菌在特定的pH范围内生长最为旺盛。发酵过程中需要维持适宜的pH值，以防止酸性或碱性环境对菌株的抑制。
■ 溶氧水平：一些益生菌是需氧的，而另一些是厌氧的。氧气的供应需要根据菌株的特性进行调节，以确保最佳的生长条件。
● 发酵时间：不同的益生菌达到高密度所需的时间不同。过长的发酵时间可能导致营养耗尽和代谢产物积累，抑制菌体生长；而过短的发酵时间则可能无法达到理想的菌体密度。
● 发酵罐设计：发酵罐的设计，包括罐体的形状、搅拌器的类型、通气系统等，都会影响发酵效果。良好的发酵罐设计可以提高益生菌的生长效率和产量。
富硒长双歧杆菌DD98高密度厌氧发酵
张旭东等[5]在实验室原有小试发酵工艺的基础上，从种子罐培养方式、发酵罐补碱量以及发酵过程中主原料的筛选等方面对现有发酵工艺进行了以7 L发酵罐作为种子罐发酵，30 L罐作为放大发酵罐的中试放大条件摸索。完整工艺参数见表1，主要关键发酵指标如下。
表1. DD98发酵的工艺参数
种子批次 | 实验项目 | 结果 | 实验项目 | 结果 |
茄子瓶菌种情况 | 培养时间 | 24 h | 培养温度 | 37℃ |
生长情况 | 茄子瓶菌苔生长较好，菌苔平铺满茄子瓶斜面 | |||
一级发酵情况 | 培养时间 | 12 h | 培养温度 | 38℃ |
生长情况 | 菌株生长较好，絮凝比较厚重 | |||
活菌数 | 7.5×108 CFU/mL | 培养终点pH | 4.30.1 | |
二级发酵情况 | 培养时间 | 约7 h | 培养温度 | 38℃ |
培养转速 | 200 r/min | 培养控制pH | 6.5 | |
活菌数 | 5.13×109 CFU/mL | 培养终点pH | 5.5 | |
碱瓶制备 | 1 L 发酵液称取3.8 g 碳酸钠，用25 mL 纯净水溶解 | |||
三级发酵情况 | 培养时间 | 5.5 h | 培养温度 | 38℃ |
培养转速 | 100 r/min | 培养控制pH | 6.5 | |
活菌数 | 3.61×109 CFU/mL | 培养终点pH | 5.5 | |
碱瓶制备 | 1 L 发酵液称取3.8 g 碳酸钠，用25 mL 纯净水溶解 | |||
● 补碱量：随着补碱量的增多，发酵罐培养时间得到了延长，但发酵终点的有效活菌数并没有明显的增多，因此确定以1倍补碱的方式，继续进行发酵。
● 种子罐培养方式：确定以1个茄子瓶接入300 mL 摇瓶，培养12 h后，接入6 L发酵液的种子罐中为最佳。
● 培养基成分：
■ 氮源：酵母粉奶粉80 g/L，酵母粉405为5 g/L。
■ 脱脂奶粉：虽然新西兰奶粉经种子罐发酵后的活菌数不是最高的，但是接种入发酵罐后的活菌数是最高的，明显高于其他品牌的奶粉。
■ 碱液配方：Na2CO3发酵所用的时间较短，活菌数高于NaOH。
■ 低聚果糖：低聚果糖未在发酵中显示出明显优势。
● 终点pH值：pH 5.5 为发酵终点。
● 发酵放大：在二级发酵和三级发酵的培养温度、培养pH、培养转速等工艺参数确定的情况下，三级发酵时间为5-7 h，发酵终点的活菌数约为3.6×09 CFU/mL。
研究结果显示，长双歧杆菌DD98各级发酵所得的活菌数均大于5×108 CFU/g（mL），远高于世卫组织中的1×106 CFU/g（mL）。在保藏35 d 后仍能够维持益生菌的益生功能，稳定性良好，值得进一步推广生产。
结语
富硒长双歧杆菌DD98的高密度厌氧发酵工艺展示了现代生物技术的巨大潜力。通过优化菌株选择、培养基成分、环境控制和发酵工艺，科学家们成功实现了这一特殊菌株的大规模生产。随着技术的不断进步，富硒长双歧杆菌DD98将在健康产业中发挥越来越重要的作用，为人类健康贡献更多的价值。
参考文献
[1] Mj VDW, Venema K. Bifidobacteria: genetic modification and the study of their role in thecolon[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2001, 49(1):378-383.
[2] Wang LQ,Zhao F,Liu F, et al.Live/dead state is not the factor influencing adhesion ability of Bifidobacterium animalis KLDS2.0603[J]. Journal of Microbiology, 2013, 51(5):584-589.
[3]高欣伟,崔树茂,唐鑫,等.长双歧杆菌的最适底物解析和高密度发酵工艺优化[J].食品与发酵工业,2021,47(19):12-20.
[4]王丹婷,王世博,刘力,等.长双歧杆菌L-DT的高密度培养[J].中国农业大学学报,2018,23(12):106-113.
[5]张旭东, 王桃, 王白鸽, 等. 富硒长双歧杆菌优势菌株的高通量选育[J]. 中国酿造, 2020, 39(2):98-102.